Доктор ветеринарных наук Катажина Стемпневска.
Государственный институт ветеринарии – Государственный исследовательский институт в Пулавах.
Цирковирусы принадлежат к роду Circovirus семейства Circoviridae. Это вирусы, у которых геном представляет собой однонитевые круговые ДНК. Это самый маленький, автономно размножающийся, вирус (Биаджини и др., 2012). Размер генома PCV1 - 1760bp, у вариантов PCV2 - 1767bp (PCV2b, 2c, 2d) и 1777 bp (PCV2e). У PCV3 среди цирковирусов размером 2000bp. Две основные рамки считывания кодируют белок репликазы (ОРС1) и капсидный белок (OРС2). В отличие от PCV1 и PCV2, в ОРС1 PCV3 нет стартового кодона ATG (Fux et al., 2018; Palinski et al., 2017).
Цирковирусы могут вызвать целый ряд заболеваний у свиней, собак, птиц, лисиц и рыб (Shen et al., 2017). У свиней это цирковирус типа 1 (PCV1), типа 2 (PCV2) и недавно обнаруженный тип 3 (PCV3). PCV1 был открыт в 70-х годах и сначала считался контаминантом культуры клеток почки свиньи непатогенным для свиней вирусом. А вот PCV2 – широко распространен в стадах свиней, его связывают со множеством заболеваний свиней - PCVAD (porcine circovirus associated diseases). PCV2 может вызвать клинические симптомы синдрома мультисистемного послеотъемного истощения свиней (PMWS - post weaning multisystemic wasting syndrome), синдрома дерматита и нефропатии свиней (PDNS - dermatitis nephropathy syndrome), заболеваний репродуктивной, дыхательной, пищеварительной, лимфатической, кровеносной, нервной системы, а также изменений на коже (Phan et al., 2016; Ellis et al., 2014). До 2003 г. PCV2a был основным генотипом, выявляемым в Соединенных Штатах и Канаде. Позже в мире произошло резкое изменение этиологической роли генотипов с PCV2a на PCV2b, а при тяжелых системных заболеваний на PCV2b.
Инфекция, вызванная только PCV2, протекает субклинически (Segalés, 2012), но при коинфекции с вирусом РРСС, парвовирусом свиней PPV и Mycoplasma hyopneumoniae проявляется клиническая форма PMWS (Аллан и др., 1999; Segalés et al., 2004). Этиологическая роль PCV2 в возникновении PDNS пока не установлена. Неоднократно предпринимались попытки экспериментально вызвать PDNS, заражая свиней PCV2, но безуспешно. Симптомы заболевания удалось получить только при совместном заражении с вирусами РРСС и TTV. Но остается не ясным, влияют ли на возникновение PDNS коинфекции с TTV1, PCV2 и PCV3. При PMWS было установлено влияние вируса TTV на тяжесть течения заболевания, вызываемого PCV2. Обострение заболевания может также вызвать коинфекция PPV и PCV2.
Диагностика PCVAD основывается на обнаружении антигена PCV2 при иммуногистохимическом исследовании (IHC) или гибридизации in situ (Sorden, 2000). Несмотря на эффективный контроль вируса с помощью коммерческих вакцин с антигеном PCV2a, создающим устойчивость ко всем цирковирусам, PCV2 по-прежнему является причиной значительных экономических потерь в мировом свинопроизводстве.
PCV3 впервые обнаружен в 2015 на одной ферме в Северной Каролине в США, на которой была повышенная смертность свиноматок (до 10,2%) и снижение показателя рождаемости на 0,6% и были симптомы PDNS. У свиноматок наблюдалась анорексия с появлением многоочаговых пятен и поверхностных воспалений кожи. Одновременно аналогичные признаки были обнаружены у мумифицированных плодов. У свиноматок гистологически методом IHC в тканях почек, лимфатических узлах, легких и образцах кожи подтверждался PDNS, но вот в ПЦР, ДНК PCV2 не выявляли. Отрицательные результаты были получены и в отношении РРСС и вируса гриппа свиней типа А. В ПЦР в тканях плодов не обнаружено геномов вируса РРСС, PCV2 и PPV. Авторы предполагают, что заражения вирусом PCV3 может вызвать симптомы, похожие на PDNS, аборты, рождение мертвых плодов из-за вертикальной передачи.
Для того, чтобы узнать, какие патогены могли быть причиной описанных выше симптомов, Палиньски и соавт. (2017) подготовили общий гомогенат из 3 абортированных плодов и подвергли образец метагеномному секвенированию. Результаты исследования, однако, не показали сходства ни с одним известным геномом вируса. Аналогичные результаты были получены для образца общих тканей от свиноматок с симптомами, похожими на PDNS.
Было проведено геномное исследование для трех рамок считывания (ОРС). Исследование показало 69,4% сходства с белками частичной репликации цирковируса свиней PorkNW2/USA/2009 и 54% сходства с китайским цирковирусом летучих мышей. Кап ОРС, кодирующие белок капсида, были на 87% похожи на PorkNW2/USA/2009 и на 36-37% на вирус PCV2 и цирковирус уток (DuCV). Третья ОРС кодировала белок на 94% похожий на OРС штамма PorkNW2/USA/2009, а также на 39% проявляла сходство с герпевирусом M169. Из-за генетического и структурного сходства с родом Circovirus и <70% идентичности аминокислотной последовательности с другими видами Палиньски и др. посчитали, что был выделен новый цирковирус свиней типа 3 - PCV3.
Т.к. вирус PCV3 генетически существенно отличался от других известных цирковирусов, Палиньски и др. (2017) провели ретроспективные исследования. С этой целью были исследованы 48 образцов тканей от животных с PDNS, в которых не было обнаружено PCV2. Образцы кожи, легких, почек, лимфатических узлов при IHC окрашивании были отрицательные на PCV2, в тоже время было установлено, что в 93,8% случаев был обнаружен PCV3 в концентрации от 1,60x104 до 3,47x104гк/мл.
Образцы гомогенатов тканей абортированных плодов, полученные во время эпидемии заболевания в Северной Каролине, были резко положительные. Наличие PCV3 в ПЦР было установлено по гену cap PCV3. Показатель Ct, полученный этих образцов, находился в диапазоне 16,7 и 21,3, что соответствовало 1,88x108 - 7,55x106 копий генома вируса (гк)/мл. В образцах тканей от свиноматок, у которых было подтверждено наличие PCV3 и наблюдались симптомы, похожие на PDNS, было установлено присутствие вируса на уровне 2,13x104 и 8,62x104гк/мл.
Для оценки уровня специфических антител используется ИФА с антигеном - белком cap rPCV3. Антитела против белка cap PCV3 обнаружены в 47 из 83 исследованных образцов сывороток (56,6%). Положительные образцы были из штата Айова, из Мексики, Северной Каролины, Небраски, Оклахомы, часть образцов была без документов о происхождении (Палиньски и др., 2017).
В свою очередь, Ку и др. сообщали, что в 2016 в Китае на 3 фермах у 356 свиноматок наблюдалась репродуктивная недостаточность и неожиданные аборты. В этих хозяйствах процент мертворожденных составлял от 5,2% до 20,1%, в то время как смертность свиноматок - от 5,4% до 10,5%. Наличие PCV2, РРСС, PED, TGE, PRV, HCV, RV было исключено в ПЦР, а PCV3 был единственным обнаруженным патогеном. Для более точных эпидемиологических исследований были взяты 222 образца мертвых плодов, тканей, спермы, а также сывороток с 35 свиноферм, расположенных в пределах 11 провинций и округов Китая. 68,6% ферм по результатам ПЦР были положительными на PCV3. В 62,2% образцов был обнаружен геном PCV2, а в 34,7% - PCV3. Одновременное присутствие обоих вирусов было обнаружено в 15,8% образцов. PCV3, как самостоятельный патоген, был обнаружен в 18,9% проб из всех обследованных провинций/округов. Вирус встречался в разных тканях: мозг, легкие, сперма, лимфоузлы, миндалины и сыворотка. Наличие вируса в сперме и в тканях мертвых плодов предполагает вертикальный путь передачи PCV3.
Нуклеотидное сходство целых геномов 9 изолятов PCV3, полученных из 4 провинций/округов, а также частичное сходство гена капсида 33 изолятов из 7 провинций/округов сравнили с ранее охарактеризованными генетически китайскими штаммами PCV3. Исследователи установили 99,0%-99,1% сходства генома китайского изолята PCV3 с американским PCV3-USA-MO2015. Нуклеотидное сходство капсида составляло 98,4%-98,9%. Геномное и нуклеотидное сходство белков капсида у китайских изолятов составляло соответственно 99,0%-100% 98,14%-100%. Результаты исследования показали более высокий уровень дифференциации внутри капсида, чем в отношении всего генома. На основании результатов филогенетического анализа китайские изоляты PCV3 были размещены в том же кластере, что и американские изоляты (PCV3-USA-MO2015). Эти штаммы проявляли эволюционную связь с китайскими коронавирусами летучих мышей, такими как: BtMr-Cv/GD202, BtPspp.-CV/GD2012, BtRs-CV/HuB2013, BtRa-Cv/JS2013, BtPa-CV-1-1/NX2013 (Ku et al., 2016).
Филогенетический анализ указывает на близкую эволюционную связь PCV3 с цирковирусом собак. Что интересно, этот вирус был найден в печени собаки, у которой были некротические васкулиты и гранулематозное воспаление лимфатических узлов, такие же симптомы наблюдались у свиноматок, инфицированных PCV3 и PCV2. Не ясно, появился ли PCV3 именно у свиней или он возник в результате межвидовой минрации или же из-за рекомбинации между неидентифицированными цирковирусами стволовых клеток (Palinski et al., 2017)
Результаты исследований архивных образцов 2002-2011 годов предполагают, что PCV3 появился в популяции свиней на несколько лет раньше, чем первые клинические случаи заболевания, связанные с ним. Предположительно, PCV3 появился 10 лет назад. PCV3 наиболее часто встречается в образцах от животных с сильными симптомами поражения дыхательной системы (Nguyen et al., 2018). В тоже время, Сараива и с соавт. (2018) предполагают, что общий предок циркулирующих в настоящее время штаммов PCV3 мог появиться, примерно, 50 лет назад. PCV3 имеет другое происхождение, чем остальные цирковирусы свиней. Невозможно было обнаружить момент рекомбинации между PCV3 и циркулирующими в настоящее время известными цирковирусами. В настоящее время PCV3, вероятно, уже распространен по всему миру, на что указывает генетическое сходство изолятов, полученных в разных частях мира.
В Китае в провинции Гуандун в декабре 2016 PCV3 выявлен у поросят с симптомами истощения, лихорадки и желтухи. Падеж был на уровне 6%. Вскрытие показало отек и гиперемию легких. В тканях и в сыворотках не было обнаружено PCV2, РРСС и PRV. При полном секвенировании генома PCV3 не обнаружено мутации в виде интеркаляции и делеции, имевшейся у штаммов PCV3 29160 и PCV3 2164, вызываших PDNS и производственные проблемы. Китайский штамм проявлял в 98,5% и 97,4% нуклеотидную гомологию с PCV3 29160 и PCV3 2164 (Shen et al., 2017).
В свою очередь, другие исследователи обнаружили PCV3 в провинции Шаньдун в Китае. Zheng et al. (2017) изучили образцы тканей от 37 мертворожденных плодов с 7 ферм. У свиноматок и рожденных поросят не отмечено каких-либо клинических симптомов инфекции. Из исследованных 222 образцов тканей (сердце, печень, легкие, почки, селезенка и пуповина), 132 образца (59,46%) было положительными на PCV3, в том числе 52 образца (39,39%) были одновременно положительны на PCV2. Гомогенаты органов были дополнительно обследованы в ПЦР на PCV1, PPV, TTV1, РРСС и CSF. В образцах от мертворожденных плодов обнаружены два варианта PCV3. Подробный филогенетический анализ показал 96% сходство обнаруженных вирусов с американским штаммом PCV3 - PCV3/Pig/USA (Zheng et al., 2017).
Ванг и др. (2017) исследовали 112 гомогенатов тканей легких, печени, селезенки, почек и лимфатических узлов от больных свиней из китайской провинции Хэбэй. Образцы собирали в 2014 – 2017 гг. 58 образцов были от свиней с PMWS, 20 от свиней с репродуктивными проблемами, 16 - от свиней с дыхательными нарушениями, 15 от свиней с диареей и 3 образца - от свиней с подтвержденным PDNS. Образцы были исследованы в ПЦР в реальном времени. ДНК PCV3 было обнаружено в 14 образцах (12%), из них наибольшее количество положительных результатов было выявлено в пулах 2017 г. (46,7%). Во всех образцах с ДНК PCV3 также обнаружена и ДНК PCV2. Эти образцы были взяты от свиней с клиническими симптомами PCVAD, из них 10 образцов с PMWS, 2 образца с PDNS, и 2 образца с проблемами репродукции. В исследуемых образцах Wangi et al. (2017) не обнаружили ДНК PCV1. Уровень коинфекции PCV2 и PCV3 составлял 12,5%, в то время как в исследованиях Ku et al., он был немного выше - 15,8% (Wang et al., 2017).
Kwon et al. (2017) в своих исследованиях доказали, что PCV3 повсеместно встречается в корейских стадах свиней. Исследователи использовали для диагностики слюну, собранную в 360 станках с 72 свиноферм. Фермы насчитывали от 200 до 500 свиноматок в основном стаде. Статус здоровья стад был не известен. Наличие генома PCV3 было установлено 44,2% образцов и в 72,6% ферм.
Геномное сходство корейских штаммов с американскими составляло 98,9%-99,8%, в то время как сходство по фрагменту ОРС2 составляло 97,9%-99,8%. Геномное сходство корейских штаммов относительно друг друга составляло 99,0%-99,9%, а сходство фрагмента ОРС2 - от 98,1% до 100%. Проведенные филогенетические исследования не показали корреляции возникновения штаммов PCV3 в пределах определенных географических границ (Kwon et al., 2017).
Fux et al. (2018) установили, что PCV3 широко распространен на фермах свиней в Германии. Исследователя изучили 1060 образцов сывороток крови поросят в возрасте 20-24 недель с 53 ферм. ДНК PCV3 была обнаружена в real-time ПЦР. У животных с виремией было получены образцы 15 полных и 9 частичных геномных последовательностей PCV3, охватывающих предполагаемую локализацию ОРС 1, 2 и 3. Филогенетический анализ полногеномных последовательностей штаммов и доступных последовательностей в базе данных Gene Bank, позволили выделить в пределах PCV3 наличие двух отдельных групп штаммов, которые можно рассматривать как генотипы PCV3. Не было обнаружено корреляции между вариантами PCV3 и их географическим происхождением. Уровень дифференциации штаммов из Германии и из других стран был примерно одинаковым.
Как оказалось, вирус PCV3 повсеместно встречается также на польских свинофермах. Стадеек и др. (2017) сообщают о первом обнаружении PCV3 на территории Европы. Исследователи изучили в 2014-2017 годах 1050 образцов сывороток крови от свиноматок и свиней в возрасте 3 - 20 недель с 14 польских свиноферм с разным размером стада и статусом здоровья животных. От 4 до 6 сывороток объединяли в пулы для исследования. Наличие генома PCV3 было подтверждено у животных 12 из 14 исследованных ферм (85,7%). На таких фермах ДНК вируса найдено в 5,9-65% пулов. ДНК PCV3 чаще всего обнаруживалось у подсвинков (26,1%) и свиней на откорме (28,0%). Детальный анализ последовательности 359-нуклеотидного участка ОРС2 показал 99,7% сходство с американским штаммом PCV3-US/SD2016 и 97,5% со штаммом PCV3 29160. Предположено, что PCV3 широко встречается в стадах свиней в Польше и, вероятно, в других европейских странах. Стадеек и соавт. (2017) отмечают, что нет корреляции между состоянием здоровья стада и наличием PCV3 в пулах крови. Различия в распространенности PCV3 могут зависеть от системы управления стадом, системы биозащиты, уровня гигиены и коинфекций, которые снижают иммунитет животных. Результаты исследования показали, что животные в возрасте 3-4 недель жизни на большинстве ферм не были заражены PCV3, что свидетельствует о защитном действии колострального иммунитета. Было отмечено, что заражение PCV3 очень часто происходило после отъема поросят (Стадеек и др., 2017).
Открытие нового цирковируса свиней, который, вероятно, является этиологическим агентом PDNS и влияет на репродуктивные функции - тревожный факт. Особенности течения инфекции PCV3 на ферме имеют схожие признаки и динамику с PCV2 (Fux et al., 2018). Филогенетический анализ всего генома показал, что PCV3 представляет собой отдельную группу, отличающуюся от других вирусов рода Circovirus (Shen et al., 2017). Учитывая, что существует всего примерно 30% идентичности между белками капсида PCV2 и PCV3, перекрестная защита от заражения, кажется маловероятной (Палиньски и др., 2017).
Для подробной характеристика вируса, его вирулентности, а также мониторинга ситуации относительно возникающих моно и коинфекций, следовало бы провести дальнейшие исследования.
Литература:
